苯甲醇是一種重要的中間體，能用于化學、制藥和聚合物工業中許多不同化合物的商業制備。目前苯甲醇的工業生產主要利用甲苯作為原料，通過化學法生成，該過程繁瑣且會生成大量副產物而污染環境。因此，如何發展苯甲醇的綠色高效生產方法一直受到工業界和學術界共同關注。
近日，湖北大學生命科學院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室李愛濤教授、陳純琪教授和郭瑞庭教授團隊共同合作，成功解決了這一難題。他們首次解析了一種特殊的“萬能酶”P450tol及其復合體晶體結構，并基于此構建了一種活性和穩定性均明顯提升的人工融合酶，實現了苯甲醇的高效綠色生物合成，相關研究成果發表于國際期刊《催化作用》。
迄今唯一可天然催化甲苯生成苯甲醇的酶
酶，這種地球生命中最強大的化學工具，通過理性設計和定向進化手段，展現出了在生物催化領域的強大功能。其中，細胞色素P450酶能夠識別多種底物(參與生化反應的物質)，因此也被稱為“萬能酶”。而利用基因工程改造P450酶來量身定制化學反應過程和生產工藝，成為一個熱門研究方向。
李愛濤從甲苯降解菌中鑒定了一種特殊的P450酶，并將其命名為P450tol。它能以甲苯為底物，生成專一的產物苯甲醇，成為迄今發現的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。
目前苯甲醇通用的工業生產采取兩步法，以甲苯為原料，需要用到劇毒的氯氣和強堿氫氧化鈉，并產生有毒副產物。“之所以會這樣，是因為傳統化學合成過程中，繞不開C-H鍵官能團化。”李愛濤解釋，由于C-H鍵具有較高的解離能，通常具有較高的熱力學穩定性和較低的化學反應性，因此，C-H鍵官能團化是傳統化學合成中一個極大的難題。
因此，李愛濤發現的P450tol讓人們看到了生物合成苯甲醇的希望。然而P450tol三維結構信息的缺乏，限制了P450tol的相關基礎研究與未來應用。
配體結合方式使反應更精準高效
要改造高效的P450tol，必須揭開酶結構的面紗。由于2020年郭瑞庭團隊首次解析了一種自給自足P450酶的全長晶體結構，李愛濤選擇與郭瑞庭團隊合作，順利解析出P450tol的空結構以及與底物甲苯及產物苯甲醇的復合體結構。這些結構信息表明，P450tol能幫助甲苯通過一步反應生成苯甲醇，且反應沒有副產物。
陳純琪介紹，P450酶的活性區都會帶一個血紅素分子參與催化反應，我們解析的P450tol也不例外，底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸組成的口袋中，甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子，兩個氨基酸(F329和A279)分別位于底物的兩側，牢牢鉗住了甲苯的苯環，甲苯前方還有一個氨基酸(V326)負責固定整個甲苯的位置，這樣催化反應就可以精確的發生在芐基位，而不是其他位置，如此精巧地反應也只有這種“萬能酶”可以做到了。
“此外，我們也觀察到了一個非常有意思的現象，甲苯或苯甲醇并不能將P450tol的活性區完全占據，還有一些多余的空間，所以我們猜測P450tol或許可以結合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。”陳純琪表示，復合體結果與團隊推測的一致，P450tol也可以與一些鹵代甲苯形成復合體，且可以精確地在芐基位發生羥基化反應。所有這些結果都顯示，配體會以有利于反應發生的方式結合并參與反應，這也使酶的反應更精準而高效。
人工融合酶有望用于工業生產
自然界中大部分的P450酶都需要一個能夠與之匹配的還原酶來提供電子以發生催化反應，這對于后續的應用也是一個難題。為了實現工業應用，尋找天然的自給自足型P450酶或者索性構建高效的自給自足型P450人工融合酶成為科研工作者關注的焦點。
“我們將P450tol和CYP116B46的還原酶結構域融合，構建出自給自足型人工融合酶，其活性、穩定性和半衰期都獲得了很大的提升。”李愛濤說。
不僅如此，P450tol-CYP116B46還可以催化丙基苯在近末端或芐基位區域選擇和立體選擇羥基化，這些羥基化產物中，有些是非常重要的藥物中間體，如安非他命、司立吉林和組蛋白酶K抑制劑的組成成分。目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例報道的穩定性和活性均大幅提升的人工融合酶，未來有望應用于工業生產中。
基于P450tol的三維結構，郭瑞庭團隊使用蛋白質工程的手段理性設計和改造，使其反應能夠更多地朝向對人類有益的方向發生。
“未來，隨著結構生物學、人工智能、酶定向進化等發展，通過理性設計和改造，獲得更多新的具有重要功能的酶來造福于人類，將會是一個重要的研發方向，我們也將繼續致力于更多P450tol人工融合酶的構建。”郭瑞庭說。(陳曦)
